組織切片伴隨著顯微鏡技術(shù)和免疫實(shí)驗(yàn)等的發(fā)展而得到廣泛的應(yīng)用。本文對(duì)其中的冰凍切片、石蠟切片、碳蠟切片、超薄切片、塑料切片等幾種常用的實(shí)驗(yàn)方法相關(guān)操作步驟進(jìn)行介紹。
冰凍切片
是免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。其最突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性,尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng) 采用冰凍切片。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片。
冰凍時(shí),組織中水份易形成冰晶,往往影響抗原定位。一般認(rèn)為冰晶少而大時(shí),影響較小,冰晶小而多時(shí),對(duì)組織結(jié)構(gòu)損害較大,在含水量較多的組織中上述現(xiàn)象更易發(fā)生。冰晶的大小與其生長(zhǎng)速率成正比,而與成核率(形成速率)成反比,即冰晶形成的數(shù)量愈多則愈小,對(duì)組織結(jié)構(gòu)影響愈嚴(yán)重。因此,應(yīng)盡量降低冰晶的數(shù)量。Fish認(rèn)為冰凍開(kāi)始時(shí),冰晶成核率較慢,以后逐漸增加,其臨界溫度為-33。C, 從-30。C降至-43。C之間,成核率急劇增加達(dá)1018,然后再減慢?;谏鲜隼碚摽刹扇∫韵麓胧p少冰晶的形成。
(1)速凍,使組織溫度驟降,縮短從-33。C43。C的時(shí)間,減少冰晶的形成。其方法有二:
①干冰-丙酮(酒精)法:將150-200ml丙酮(酒精)裝入小保溫杯內(nèi),逐漸加入干冰,直至飽和呈粘稠狀,再加干冰不再昌泡時(shí),溫度可達(dá)-70℃C,用一小燒杯(50-100ml)內(nèi)裝異戊烷約50ml,再將燒杯緩慢置入干冰丙酮(純酒精)飽和液內(nèi),至異戊烷溫度達(dá)-70℃時(shí)即可使用。將組織(大小為1cm×0.8cm×0.5cm)投入異戊烷內(nèi)速凍30-60s后取出,或置恒冷箱內(nèi)以備切片,或置-80℃低溫冰箱內(nèi)貯存。
②液氮法:將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)(直徑約2cm),如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒(méi)組織,然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi),當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí) 即開(kāi)始?xì)饣序v,此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中,大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆?,或置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。
(2)將組織置于20%-30%蔗糖溶液1~3天,利用高滲吸收組織中水分,減少組織含水量。
影響冰凍切片的因素較多,因此,技術(shù)難度較大,選擇好的冰凍切片機(jī)是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵。目前冰凍切片機(jī)有兩類:
①恒慢冰凍切片機(jī)(Cryastat):為較理想的冰凍切片機(jī),型號(hào)很多,但其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于-30℃C低溫密閉室內(nèi),故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響,可連續(xù)切薄片至2-4μm,完全能滿足免疫組織化學(xué)標(biāo)記要求。切片時(shí),低溫室內(nèi)溫度以-15℃~18℃為宜,溫度過(guò)低組織易破碎,抗卷板的位置及角度要適當(dāng),載玻片附貼組織切片,切勿上下移動(dòng)。
②開(kāi)放式冰凍切片機(jī):包括半導(dǎo)體致冷切片機(jī)和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷凍切片機(jī)。切片時(shí)暴露空氣中,溫度不易控制,切片技術(shù)難度 大,在高溫季節(jié) ,切片更加困難,且切片厚8~15μm,不易連續(xù)切片,但其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)廉,國(guó)內(nèi)有生產(chǎn)。
冰凍切片后如不染色,必須吹干,貯存低溫冰箱內(nèi), 或進(jìn)行短暫預(yù)固定后貯存冰箱保存
石蠟切片
其優(yōu)點(diǎn)是組織結(jié)構(gòu)保存良好,在病理和回顧性研究中有較大的實(shí)用價(jià)值,能切連續(xù)薄片,組織結(jié)構(gòu)清晰,抗原定位準(zhǔn)確。用于免疫組化技術(shù)的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同:①脫水、透明等過(guò)程應(yīng)在4℃。C下進(jìn)行,以盡量減少組織抗原的損失。②組織塊大小應(yīng)限于2cm×1.5cm×0.2cm,使組織充分脫水、透明、浸蠟。③浸蠟、包埋過(guò)程中,石蠟應(yīng)保持在60℃以下,以溶點(diǎn)低的軟蠟最好(即低溫石蠟包埋)。
以上全過(guò)程為18-24h,也可在室溫內(nèi)使用自動(dòng)脫水機(jī)代替。如組織塊小,直徑小于0.5cm,可用快速石蠟包埋切片,全過(guò)程只需4h左右。
石蠟切片為常規(guī)制片技術(shù),切片機(jī)多為輪轉(zhuǎn)式,切片厚度2~7μm,應(yīng)用范圍廣,不影響抗體的穿透性,染色均勻一致。由于甲醛固定、有機(jī)熔劑和包埋劑對(duì)組抗原有一定的損害及遮蔽,使抗原特征發(fā)生改變。有人報(bào)告經(jīng)蛋白酶消化,可以改善光鏡免疫組化染色強(qiáng)度,常用的有胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蠟切片應(yīng)入37℃恒溫箱過(guò)夜,這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長(zhǎng)期貯存,可存放于4℃冰箱內(nèi)備用。
石蠟切片優(yōu)點(diǎn)較多,但在制片過(guò)程中要經(jīng)過(guò)酒精、二甲苯等有機(jī)溶劑處理,組織內(nèi)抗原活性失去較多,有人采用冷凍干燥包埋法(Freeze drying embedding methed),可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì),防止蛋白變性和酶的失活,從而減少了抗原的丟失。該法是將新鮮組織低溫速凍,利用冷凍干燥機(jī)(Freezing dryer)在真空、低溫條件下排除組織內(nèi)水分 ,然后用甲醛蒸氣固定干燥的組織,最后將組織浸蠟、包埋、切片。此法可用于免疫熒光標(biāo)記、免疫酶標(biāo)記及放射自顯影。
振動(dòng)切片
用振動(dòng)切片機(jī)(Vibratotme),可以把新鮮組織(不固定不冰凍)切成厚片20~100μm,以漂浮法在反應(yīng)板進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,然后在解剖顯微鏡下檢出免疫反應(yīng)陽(yáng)性部位,修整組織進(jìn)行后固定,最后按電鏡樣品制備、脫水、包埋、超薄切片、染色觀察等。組織不冰凍,無(wú)冰晶形成和組織抗原破壞,在免疫組化染色前避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對(duì)抗原的損害,能較好地保留組織內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細(xì)胞膜抗原,主要用于顯示神經(jīng)系統(tǒng)抗原分布研究。這種包埋前染色,尤其實(shí)用于免疫電鏡觀察。
塑料切片
塑料包埋切片常用包埋劑有甲基丙烯酸鹽類(Glycol methacrylate, GMA)及環(huán)氧樹脂類(Epon 812,618),其優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)作光鏡和電鏡檢測(cè),能相互對(duì)照所查抗原,定位準(zhǔn)確。塑料包埋切片可切出比石蠟切片更薄的切片,光鏡切片可薄至0.5~2um,故稱半薄切片(Semithin section)。GMA保存抗原較好,不與組織產(chǎn)生共聚合,但形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)欠佳。環(huán)氧樹脂如Fpon和Araldite能較好地保存形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu),但在聚合過(guò)程中易和組織起作用,改變抗原結(jié)構(gòu)。塑料包埋切片由于處理程序繁多,抗原活性易丟失。同時(shí)半薄切片進(jìn)行免疫染色時(shí),抗血清不易穿透樹脂,因此,塑料切片主要用于免疫電鏡的超微切片前定位。包埋前染色的標(biāo)本,切片薄切片后不需染色,直接在相差顯微鏡下觀察免疫反應(yīng)部位呈黑點(diǎn)狀,定位后進(jìn)一步作超薄切片,這樣,可以明顯提高免疫電鏡陽(yáng)性檢出率。
超薄切片
電鏡標(biāo)本制作,應(yīng)用超薄切片機(jī)(Ultrotome)進(jìn)行切片。
碳蠟切片
碳蠟(Carbowax),學(xué)名聚乙烯二醇(Polyethlene glycol, PEG)為水溶性蠟。根據(jù)其分子量不同,碳蠟有多種,如400、800、1000、1500、4000、6000等,用于組織包埋的有1500、4000兩種,其熔點(diǎn)分別38℃C和52。C左右,常溫下為固體石蠟狀,加溫熔化呈液體狀。
本法的特點(diǎn)是組織固定水洗后,不需脫水透明可直接浸蠟包埋,且切片方法與常規(guī)石蠟切片相同。切下的組織片漂浮水面后自然展開(kāi),碳虹迅速深化,組織片即可展平,制片過(guò)程簡(jiǎn)單易行。
具體操作簡(jiǎn)述如下:組織塊不宜過(guò)大,一般限定在1.5cm×1cm×0.1cm以內(nèi)。①組織固定后充分水洗去除固定液,用濾紙吸干組織表面水。②將組織浸入碳蠟(1500)內(nèi),45℃30min。③再次浸入混合混合碳蠟液(1500和4000等量混合液),52℃ 30min。④浸入等量混合碳蠟液(或根據(jù)氣溫、濕度變化調(diào)整4000和5000混合比例,如氣溫高濕度大可以4000:1500=3:2混合,反之,則2:3混合)。⑤用等量混合碳蠟或調(diào)整混合碳蠟包埋成組織蠟塊。⑥切片與石蠟切片相同。在操作過(guò)程中,碳蠟組織塊應(yīng)盡量避免與水或冰接觸,貯存時(shí)應(yīng)密封干燥冷藏。
本法優(yōu)點(diǎn)是操作程序減少,時(shí)間縮短,組織不經(jīng)有機(jī)溶劑損害、溫度低、抗原性保存比石蠟切片好,組織結(jié)構(gòu)清晰。缺點(diǎn)是夏季室溫高時(shí)切片較困難,連續(xù)切片不如石蠟切片順利;由于碳蠟有強(qiáng)吸濕性,不易長(zhǎng)期保存。
從上文我們可看到,各種的組織切片方法的優(yōu)點(diǎn)和不足各不同,例如冰凍切片法能較好地保存抗原的活性但實(shí)驗(yàn)要求高,而石蠟法則在保存組織結(jié)構(gòu)完整性上表現(xiàn)出色但活性保存度低,而碳蠟法操作簡(jiǎn)單但不易保存。